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Universidad CÓRDOBA (2010)

ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD GENETICA DE POBLACIONES BACTERIANAS EN LA RIZOSFERA DE OLIVO (OLEA EUROPAEA L. SUBSP. EUROPAEA) EN ANDALUCIA

ARANDA OCAMPO, SERGIO

Titre : ESTRUCTURA Y DIVERSIDAD GENETICA DE POBLACIONES BACTERIANAS EN LA RIZOSFERA DE OLIVO (OLEA EUROPAEA L. SUBSP. EUROPAEA) EN ANDALUCIA

Auteur : ARANDA OCAMPO, SERGIO

Université de soutenance : Universidad CÓRDOBA

Grade : Doctorado 2010

Résumé
El olivo (Olea europaea L. subsp. europaea) ha sido culturalmente y económicamente el principal cultivo oleaginoso de la Cuenca Mediterránea. España es el mayor productor de aceite de oliva en el mundo, y Andalucía, la región sur del país, es el principal área de cultivo con 62% de la superficie de olivar en España, ocupando >1.5 millones ha, y un 17% de su superficie total en un monocultivo impresionante. En España, el olivo se puede encontrar en dos formas, silvestre (Olea europaea L. subsp. europaea var. sylvestris) y cultivada (Olea europaea L. subsp. europaea var. europaea). Las interacciones planta-microorganismo en la rizosfera y endosfera ha sido objeto de considerables estudios, ya que las comunidades bacterianas desempeñan un importante papel en el balance, desarrollo y funcionamiento del ecosistema suelo en diferentes sistemas agrícolas en muchas especies de plantas cultivadas. Esta Tesis Doctoral, se ha centrado en el estudio de la estructura y diversidad genética de las comunidades bacterianas de la rizosfera de olivos cultivados y silvestres en Andalucía, determinando el papel que los sistemas de manejo del suelo y los factores asociados a la planta pueden tener sobre éstas. En España, recientemente se han introducido métodos alternativos del manejo del suelo para reducir al mínimo la vulnerabilidad de los olivares a la erosión del suelo, uno de los principales problemas para la sostenibilidad del olivo en Andalucía, incluyendo el no-laboreo combinado con el control mecánico de malas hierbas, laboreo reducido con y sin control de malas hierbas y siembra de cubiertas vegetales en el otoño y eliminación de malas hierbas con herbicidas en la primavera y/o posterior desbroce o pastoreo. En este trabajo, se utilizó el análisis FT-RFLP (Análisis del Polimorfismos de Longitud del Fragmento de Restricción Terminal Fluorescente) de las secuencias amplificadas de la región 16S del ADNr para estudiar las diferencias en la estructura de las comunidades bacterianas en muestras de suelo de 46 plantaciones comerciales de olivo orgánico y 12 áreas naturales cercanas con diferentes tipos de suelo. Las fincas de olivar estudiadas han estado sometidas a los diferentes sistemas de manejo de suelo durante largo tiempo en dos de las zonas más representativas para el cultivo de olivar en Andalucía, y representan ejemplos de sistemas agroforestales y plantaciones tradicionales. Nuestros resultados demostraron que dentro de cada finca de olivar tanto el tipo de suelo como el manejo de éste contribuyeron en este orden a modificar la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas de acuerdo a los valores de los índices de Riqueza y Shannon Weiner. Los suelos de olivar de Sierra Morena con laboreo ligero o pastoreo con ovejas durante todo el año, presentaron mayores valores de estos índices de diversidad comparados con todos los sistemas de manejo del suelo en Campiña (laboreo convencional y cobertura del suelo con desbroce). Mediante este análisis FT-RFLP algunos fragmentos de restricción terminal han sido identificados y asociados significativamente a sistemas de manejo de suelo específicos, los cuales podrían ser utilizados en el futuro como indicadores para evaluar el efecto de cambios en el manejo de suelo en la modificación de las propiedades biológicas del suelo incluyendo la calidad biológica del mismo. Entre los árboles cultivados y silvestres, el olivo es una de las especies de mayor longevidad y riqueza en variabilidad genética. En España, más de 200 variedades son actualmente cultivadas. En Andalucía ocho cultivares de olivo (Hojiblanca, Lechín de Sevilla, Manzanilla de Sevilla, Nevadillo Negro, Picual, Picudo, y Verdial de Huévar) representan >90% del área total cultivada, y nuevos cultivares (Arbequina y Frantoio) están siendo actualmente introducidos. En esta Tesis Doctoral, utilizando un enfoque tanto cultivo-dependiente e independiente (FT-RFLP de las secuencias amplificadas de la región 16S ADNr), evaluamos la influencia específica del genotipo de olivo, vivero de origen de los plantones, y el tiempo de incubación en la estructura de las comunidades bacterianas así como en las comunidades bacterianas cultivables totales (BCT) y Pseudomonas fluorescentes (Ps) en la rizosfera y endosfera de seis cultivares (Arbequina, Frantoio, Hojiblanca, Manzanilla de Sevilla, Picual, y Picudo). Nuestros resultados indicaron que en primer lugar el vivero de origen, y en segundo lugar el genotipo del olivo, tuvieron una influencia significativa en la estructura de las comunidades iniciales y densidad de población de bacterias cultivables en la rizosfera y endosfera. En general, los cultivares Arbequina y Frantoio mostraron los mayores niveles de densidad de población. Asimismo, la estructura de las comunidades bacterianas de la rizosfera de seis cultivares de olivo muestreados en distintos tiempos de crecimiento fueron diferenciados en primer lugar en función del tiempo de muestreo y en segundo lugar en función del genotipo del olivo, con densidad de poblaciones de BCT y Ps manteniéndose estables o incrementando sus niveles de densidad de población durante el tiempo de crecimiento. En esta Tesis Doctoral, nuestra hipótesis fue que ambas formas de olivo, cultivada y silvestre, pueden ser una importante fuente de variabilidad genética la cual puede contener comunidades bacterianas en la rizosfera con importantes aplicaciones en la medicina, veterinaria, agricultura o industria. Mediante un enfoque de análisis polifásico, examinamos la estructura y diversidad de las comunidades bacterianas en la rizosfera de olivos silvestres en Andalucía. Primero, utilizando la técnica de análisis FT-RFLP de la región 16S ADNr, encontramos una alta heterogeneidad en la composición de las comunidades bacterianas de la rizosfera, sugiriendo la existencia de comunidades específicas en función del genotipo de la planta y localización geográfica, siendo cada reducto de acebuche un reservorio único de diversidad. Posteriormente, investigamos el potencial antagonista de esas poblaciones bacterianas cultivables asociadas a la raíz. De un total de 675 aislados bacterianos de la rizosfera y endosfera de olivos silvestres, 94 (14%) mostraron una fuerte actividad antagonista in vitro contra V. dahliae patotipo defoliante, el cual es considerado uno de los más importantes patógenos que afectan al cultivo del olivo en el mundo. La proporción más alta de antagonistas se obtuvo de la rizosfera (59,6%) en comparación con la endosfera (40,4%). En total, la mayoría de los antagonistas (entre un 58,5 a 78,3%), mostraron actividad proteolítica, lipolítica, quitinolítica, produjeron ácido indol-acético y sideróforos. Mediante la secuenciación del gen 16S del ADNr, los antagonistas se identificaron indicando que la mayoría de las bacterias pertenecen al género Bacillus (56,4%), Pseudomonas (27,7%) y Paenibacillus (7,4%). Asimismo, varios de los aislados bacterianos que se identificaron no habían sido citados previamente en olivo incluyendo Acinetobacter sp. (3,2%), Chryseobacterium vyrstaatense (2,1%), Rhodococcus wratislaviensis (1,1%), y Rahnella sp. (1,1%). En general, varias de estas bacterias mostraron un alto y gran número de mecanismos de antagonismo, por lo que deben ser consideradas para futuros análisis como potenciales agentes de biocontrol contra V. dahliae en olivo. Finalmente, realizamos un intenso estudio centrado en nuevas bacterias pertenecientes a Duganella spp. con pigmentación morada productoras de violaceína con interés biotecnológico habitando la rizosfera de olivos silvestres y cultivados en el sur de España. Mediante una caracterización fisiológica y bioquímica, análisis filogenético de diferentes genes incluyendo 16S ADNr, gyrB y vioA (implicado en la síntesis de violaceína), aislamos e identificamos por primera vez Duganella spp. asociadas con la rizosfera de plantas leñosas en medio ambientes de clima Mediterráneos que son capaces de producir violaceína, un metabolito secundario de color azul-morado con importantes aplicaciones biológicas, médicas e industriales de alto interés biotecnológico. Las siete cepas de Duganella spp. estudiadas pudieron ser identificadas como dos potenciales especies nuevas y fueron diferenciadas de acuerdo a su huésped de origen (Duganella baetica en olivos silvestres versus Duganella olivae en olivos cultivados). Todas las cepas de Duganella spp. produjeron violaceína in vitro, con niveles de producción natural más altos (hasta X65) que los citados en la literatura para cepas de otras especies bacterianas productoras de violaceína. Este alto rendimiento, hacen de estas bacterias buenas candidatas para su explotación biotecnológica, ya que los bajos rendimientos en la producción de violaceína se consideran una de las principales limitaciones de las cepas silvestres para su producción masiva y explotación comercial. Aunque no se demostró actividad inhibidora in vitro frente a bacterias gram-negativas y hongos fitopatógenos, el filtrado crudo de violaceína si demostró actividad inhibidora contra bacterias gram positivas. También observamos que las cepas de Duganella spp. de olivos silvestres y cultivados mostraron actividad proteolítica y lipolítica y una débil producción de sideróforos lo cual merece una investigación más extensa como potenciales inoculantes de plantones de olivo para mejorar su crecimiento y el establecimiento y supresión de patógenos del suelo.

Mots clés : MICROBIOLOGIA DE SUELOS ; CONTROL BIOLOGICO DE ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS ; BACTERIOLOGIA

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Page publiée le 18 décembre 2011, mise à jour le 8 février 2019