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Université de Technologie de Compiègne (2016)

Production et caractérisation de l’amylopullulanase de la levure Clavispora lusitaniae ABS7 isolée de blé cultivé et stocké en zones arides

Dakhmouche-Djekrif, Scheherazed

Titre : Production et caractérisation de l’amylopullulanase de la levure Clavispora lusitaniae ABS7 isolée de blé cultivé et stocké en zones arides

Auteur : Dakhmouche-Djekrif, Scheherazed

Université de soutenance : Université de Technologie de Compiègne cotutelle Université des Frères Mentouri Constantine

Grade : Doctorat 2016

Résumé
Cette étude vise à produire deux enzymes amylolytiques (a-amylase et pullulanase) thermostables par des levures contaminant le blé récolté dans des zones semi arides et arides (Biskra - Sahara, Sud Algérien) et capables d hydrolyser à la fois les liaisons a-1-4 et a-1-6 de polysaccharides comme l amidon et le pullulane, molécules d intérêt industriel. Après isolement et caractérisation de colonies levuriennes, la méthode de plate-test-agar permet d isoler des souches amylolytiques et de montrer que la souche L7 est la plus performante dans la production enzymatique parmi une douzaine de souches de levures productrices d a-amylase et de pullulanase thermostables. L identification des souches, basée sur les caractères morphologiques, les tests biochimiques et la biologie moléculaire a permis de répartir la population comme suit : 50% Clavispora lusitaniae (forme anamorph Candida lusitaniae), 25%, Pichia guilliermondii, 8% Pichia carribbicca, 8% Meyerozyma guilliermondii et 8% Rhodotorula rubra. Par sa richesse en amidon, le biotope du blé est favorable à la survie des levures amylolytiques. La majorité de ces souches dont la souche L7 est productrice de pseudo ou vrai mycélium et est tolérante à certains paramètres comme la température, la salinité, les stress osmotique et éthanolique. La souche de levure L7, Clavispora lusitaniae ABS7, semble être la plus performante dans la production d enzymes thermostables. Son identification moléculaire a montré deux bandes avec l endonucléase HAE III alors que les autres souches de la même espèce de Clavispora lusitaniae (L5, L9, L10, L11 et L12) présentent une seule bande. En conditions optimales (agitation 136,56 rpm, température 54,14Ċ, amidon 2,66g/l, extrait de levure 0,365g/l, sels 8, 75ml/l et oligo-éléments 4,3ml/l en erlenmeyers de 250 ml), la production maximale atteint les valeurs suivantes : 13456,36+-300 UI pour l a-amylase et 12611, 6+-154 UI pour la pullulanase. Ces performances sont en accord étroit avec la prédiction du modèle statistique évaluée à 13231UI pour l a-amylase et 12825,5 UI pour la pullulanase. La production optimisée a pratiquement doublé par rapport à la production avant l optimisation (6639,16 UI pour l a-amylase et 6308,5 UI pour la pullulanase). En conditions optimales et en fermenteur de 2 L, la production maximale pour les deux enzymes de la levure Clavispora lusitaniaeABS7 est obtenue au bout de 28 h avec un optimum de croissance obtenu à 40 heures. La production des deux enzymes n est donc pas associée à la croissance. La production maximale des deux enzymes s effectue à pH 8. pic protéique. L élution sur DEAE-cellulose confirme la présence des deux activités dans la même fraction. Les deux enzymes sont donc présentes sur la même molécule. L a-amylase et la pullulanase sont purifiées avec un taux de purification de 50,5 et 44,6 respectivement et des rendements respectifs de 23,9% et 21,1%. L extrait purifié montre une seule bande sur le gel de SDS-PAGE avec un poids moléculaire estimé à 75KDa et une activité amylolytique contenant à la fois les activités a-amylasique (indépendante de Ca2+) et pullulanasique (une métalloenzyme à calcium). La souche de la levure Clavispora lusitaniae ABS7 possède donc une enzyme amylolytique avec deux sites actifs. La CCM révèle une enzyme qui hydrolyse l amidon en maltose et glucose et le pullulane en maltotriose, maltose et glucose, ce qui montre que l enzyme est saccharifiante et correspond à une pullulanase de type II (amylopullulase). L optimisation de l immobilisation de l enzyme a permis l amélioration de l activité : a-amylasique à 4907,75 UI (rendement 72,3 %) et celle de la pullulanase à 4491,83 UI (rendement 70,1%) avec un pH optimum de 8,5. Il ressort de notre étude que l amylopullulanase type II libre de Clavispora lusitaniae ABS7 est thermostable puisqu elle résiste à un traitement thermique de 75Ċ pendant 3 heures d incubation et conserve 88% de son activité initiale.

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Page publiée le 14 novembre 2017